植物自身荧光模糊的消除

自体荧光原理

自荧光是由某些细胞结构和特性引起的光致发光(PL)的自然发射。当一个物体接受光时，它的分子吸收光子(光)，激发电子。光致发光是当电子回到较低的能量状态时发生的光发射。当细胞器(如线粒体和溶酶体)或细胞外基质成分(如胶原蛋白和弹性蛋白)或含异alloxazine环黄素的化合物(如NADH和核黄素)自然发出激发光时，就存在自身荧光。在植物细胞中，叶绿素(一种用于光合作用的绿色色素)和填充细胞壁的木质素是显示自身荧光的典型元素。

自发荧光的波长

一般来说，当上述细胞结构被波长在350到500 nm之间的光激发时，可以观察到自身荧光，并相应地发出波长在350到550 nm之间的光。
例如，NADH是一种典型的黄素化合物，可以发出自荧光，它被340 nm波长范围内的光激发，并在460 nm左右发出蓝色的自荧光。另一方面，植物通过光合作用吸收的光产生能量的叶绿素，在680 nm左右的波长上显示自荧光。
了解物质激发光的波长及其响应性和其自身荧光的波长是清晰观察目标物质和组织的关键。

植物荧光观测存在的问题

在观察植物等多细胞生物时，通常会使用荧光蛋白选择性地标记目标细胞和结构，并放大视野，以便更近距离地观察这些细胞和组织。然而，如果在荧光显微镜下观察植物时，目标细胞和蛋白质的信号较弱，则自身荧光可能是阻止它们被区分的因素。特别是在观察植物细胞时，叶绿素和其他表现出自身荧光的物质被认为是荧光模糊的主要原因之一。
由于植物自身的荧光导致荧光模糊，使得对目标物质的观察变得困难，因此，为了获得更清晰的图像以便于观察和分析，我们面临的挑战是如何克服这种模糊现象。

消除自身荧光引起的荧光模糊

滤光片是防止叶绿素自身荧光影响植物细胞观察的常用方法。
如前所述，叶绿素的自身荧光在680 nm的波长范围内发射。使用适合波长波段的荧光滤光片组，消除波长在680 nm左右的光，可以实现荧光观测，保证不受自身荧光的影响，如荧光模糊。
如果导致荧光模糊的自身荧光波长不能被识别，或者它没有唯一的波长特性，首先，你应该通过使用标准的荧光滤光片测试不同的波长来找到可以切断自身荧光的波长范围，然后使用合适的滤光片来促进对目标物质的观察。

植物观察面临的挑战和需求

使用滤光片消除自荧光产生的模糊需要时间和精力来识别要消除的自荧光波长和对应的滤光片。当观察植物的细胞内结构时，在某些情况下，你可能会通过解剖器官和将组织切成薄片来准备标本。这样的标本制备需要先进的技术技能和经验。此外，在准备切片时对工厂施加机械力会引起意想不到的反应。
传统上，从组织切片的二维图像分析和评价本质上的三维结构也是困难的。总之，植物研究的两大挑战和需求是能够有选择地观察目标细胞和组织，具有清晰、无荧光模糊的图像，能够准确、高效地观察三维结构。

清晰，完全聚焦的图像，没有荧光模糊

KEYENCE公司的BZ-X800一合一荧光显微镜具有切片功能，在不使用激光的情况下，可以消除荧光在光学上的模糊，并能轻松捕捉清晰的图像。
切片功能采用光学切片算法*消除荧光模糊，焦点位置只留下清晰的荧光，可以快速方便地获取清晰的图像。此外，BZ-X800在使用section函数的同时，可以在Z方向上捕获多幅图像，因此在整个样品深度的所有高度上，BZ-X800可以准确地只采集荧光信号，而不受荧光模糊的影响。在这些多张图片中，BZ-X800只将焦点最明显的区域挑出来并组合在一起，然后用它们创建一个完全聚焦的图像。这为操作人员节省了在常规滤光器中找到合适滤光器的时间和劳力，滤光器可以消除波长，并直接对清晰的图像进行观察。

*光学切片算法使用结构化照明来切割分析区域(z-切片)，当只提取聚焦表面的信号。金属卤化物灯的激发光具有从紫外到近红外的宽波长范围，通过电子投影元件，它以网格模式将光投射到样品上(结构照明)。网格只投射到标本的聚焦区域。BZ-X800在z方向移动网格时捕获多幅图像，通过从这些图像中提取网格投影的区域，防止了垂直方向上荧光模糊的影响。该算法自动生成由聚焦区域信号组成的清晰图像。

三维图像构建，灵活观察

传统上，仅使用来自多个截面样本的几个二维图像来分析和评估三维组织结构是很困难的。
使用BZ-X800，只需单击一次，就可以从Z轴上以恒定俯仰的不同点捕获的Z-堆叠图像构建3D图像。此外，用户可以旋转、放大或缩小3D图像，并在观看显示器时通过鼠标操作观察3D图像的横截面。
无论角度如何，3D图像都是完全聚焦的，无论你移动鼠标，都支持对局部荧光信号的准确理解——你永远不会看不到你的188bet在线目标细胞或组织。

1. 

   正常的观察

3. 

   切片观察